Методические рекомендации по применению методов биотестирования для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения. Исследование качества воды методом биотестирования

Введение

Многие известные заболевания человека имеют соответствие в генетическом коде плодовой мушки. Исследования на дрозофиле помогают понять фундаментальные биологические процессы, которые непосредственно связаны с человеком и его здоровьем. Они используются в моделировании некоторых заболеваний человека, например, таких как, болезни Паркинсона, Хантингтона и Альцгеймера, а также для изучения механизмов, которые лежат в основе рака, диабета, иммунитета, наркотической зависимости и многих других.

Drosophila melanogaster широко используется и для оценки качества окружающей среды. Так же она является генетической моделью при исследованиях насекомых, которые могут переносить опасные инфекционные болезни человека (Например, Culex pipiens - Вирус Западного Нила, Anopheles gambiae - малярию, Aedes aegypu - лихорадку Денге). Результаты исследований, полученные на дрозофиле, также дают ключ к пониманию генетических процессов, выявляемых при изучении важных для сельского хозяйства насекомых, таких как пчелы и тутовый шелкопряд, и насекомых - вредителей, к которым относится саранча и многие виды жуков и тлей.

Актуальность темы дипломной работы состоит в том, что Drosophila melanogaster широко используется и имеет огромное значение в жизни человека. Но во время ее культивирования и использования в исследованиях можно столкнуться с рядом проблем, которые необходимо изучать для облегчения работы с ней. Кроме того, существует мало литературы по методам ее культивирования.

Объект исследования - методика культивирования и использования Drosophila melanogaster в биотестировании.

Предмет исследования - эффективность методики.

Цель работы - разработать методы оптимизации использования Drosophila melanogaster в целях биотестирования.

Для того чтобы достигнуть поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить проблемы, связанные с биотестированием Drosophila melanogaster.

2. Найти подходы к реализации решения проблем.

3. Экспериментальным путем установить эффективность собственных и известных из литературы путей повышения эффективности использования Drosophila melanogaster как тест - объекта.

Биотестирование, как метод экологического исследования

Суть биотестирования и предъявляемые к его методам требования

молекулярный генетический дрозофила биотестирование

Биотестирование -- это такая процедура установления токсичности среды, при которой специальные тест - объекты информируют об опасности, при этом не зависят от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций [Ляшенко, 2012].

Определение характера и степени токсичности тестируемой среды и является целью биотестирования.

Само биотестирование основано на регистрации биологически важных показателей, так называемых тест - функций, исследуемых тест - объектов. После регистрации этих показателей производиться оценка их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности. В свою очередь тест - функции бывают биологические и физиологические. К биологическим функциям относятся выживаемость, плодовитость, размножение и качество потомства, а к физиологическим - дыхание, показатели крови, активность питания, обмен веществ [Ляшенко, 2012].

Тест - объектами (или иначе тест - организмами) называют такие биологические объекты, которые используют для оценки токсичности химических веществ. Проявляющийся токсический эффект регистрируют и оценивают в эксперименте.

Биотестирование в отличие от аналитических методов подразумевает слежение за антропогенными и природными процессами в биологических средах, которые включают всю совокупность взаимодействия агентов внешней среды с живым, в том числе и такие как выяснение ответной реакции биосред на антропогенные и природные воздействия [Иваныкина, 2010]. Такими ответами могут служить реакции на стресс - факторы. Методы имеют много преимуществ. Например, они более информативны для определения прямой реакции экосистемы на антропогенное воздействие. С помощью данных подходов в экологическом мониторинге можно получать объективную, а также количественную оценку процессов регенерирования объектов окружающей среды. Можно также, благодаря этим методам, оценить эффективность мероприятий по охране природы [Балакирев, 2013]. Также еще одним достоинством метода является определение общей токсичности, которые создаются присутствием экотоксикантов, не нормирующиеся существующими стандартами, но обладающие способностью вызывать разнообразные генотоксические, токсические, цитотоксические или мутагенные эффекты [Журавлева, 2006].

Кроме того, химико-аналитические и гидрохимические методы могут быть неэффективными, в силу их недостаточно высокой чувствительности. Биота может подвергаться токсическим воздействиям, которые не регистрируются техническими средствами связи с тем, что любой аналитический датчик не способен воспринимать такие низкие концентрации веществ по сравнению с живыми объектами [Мелехова, 2007].

В основе биотестирования лежит метод биологического моделирования. В определенной мере всякая модель является специфической формой отражения действительности. При биотестировании происходит перенос знаний с примитивной системы (смоделированной в лаборатории) на более сложную систему (экосистема в реальных условиях) [Маячкина, 2009]. По некоторым данным биотестирование - обязательное дополнение к химическому анализу, а также является интегральным методом оценки токсичности водной среды [Туманов, Постнов, 1983]. В стандарты по контролю качества вод различного назначения включены и методы биотестирования [Александрова, 2013].

Для того чтобы оценить состояние разных организмов, находящихся под воздействием естественных или антропогенных факторов проводят тестирование на биологических объектах, которые представляют собой комплекс различных подходов. Эффективность физиологических процессов, которые обеспечивают нормальное функционирование организма (например, такие как дыхание, обмен веществ, активность питания и тому подобное) является основным показателем их состояния. На воздействие среды организм реагирует посредством сложной физиологической системы буферных гомеостатических механизмов, но только при оптимальных условиях поддерживает оптимальное протекание процессов развития. Под воздействием неблагоприятных условий гомеостаз может быть нарушен, что приводит к состоянию стресса. Эти нарушения могут происходить до появления изменений, которые используются параметрами жизнеспособности. Таким образом, методы биотестирования, основываются на исследовании механизмов гомеостаза и его эффективности, а также позволяют уловить присутствие воздействия стресс - фактора раньше, чем другие, обычно используемые методы [Мелехова, 2007].

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Методы биотестирования природных и сточных вод

1. Основные принципы методов биотестирования и критерии токсичности вод

Биотестирование (биологическое тестирование) - оценка качества объектов окружающей среды (воды и пр.) по ответным реакциям живых организмов, являющихся тест-объектами.

Это широко распространенный экспериментальный методический прием, который представляет собой токсикологический эксперимент. Суть эксперимента заключается в том, что тест-объекты помещают в исследуемую среду и выдерживают (экспонируют) определенное время, в течении которого регистрируют реакции тест-объектов на воздействие этой среды.

Приемы биотестирования широко применяются в различных областях природоохранной деятельности и используются по различным назначениям. Биотестирование является основным методом при разработке нормативов ПДК химических веществ (биотестирование токсичности индивидуальных химических веществ), и, в конечном итоге, при оценке из опасности для окружающей среды и здоровья населения. Таким образом, оценка уровня загрязнения по результатам химического анализа, т.е. интерпретация результатов с точки зрения опасности для окружающей среды, также в значительной степени опирается на данные биотестирования.

Методы биотестирования, будучи биологическими по сути, близки по смыслу получаемых данных к методам химического анализа вод: как и химические методы, они отражают характеристику воздействия на водные биоценозы.

Требования, применяемые к методикам биотестирования:

Чувствительность тест-организмов к достаточно малым концентрациям загрязняющих веществ.

Отсутствие инверсии ответных реакций тест-организмов на разные значения концентрации загрязняющих веществ в пределах тех значений, кот-е отмечены в природных водах;

Возможность получать надежные результаты, метрологическая обеспеченность методик;

Доступность тест-организмов для сбора, простота культивирования и содержания в условиях лаборатории;

Простота выполнения процедуры и технических приемов биотеста;

Низкая себестоимость работ по биотестированию.

Развиваются два основных направления работ по биотестированию:

Подбор методик с использованием гидробионтов, охватывающих основные иерархические структуры водной экосистемы и звенья трофической цепи;

Поиск наиболее чувствительных тест-организмов, которые позволили бы уловить низкий уровень токсичности при обеспеченной гарантии надежности информации.

Для токсикологической оценки загрязнения пресноводных экосистем на основе биотестирования водной среды рекомендовано использовать несколько видов тест-объектов: водоросли, дафнии, цериодафний, бактерии, простейшие, коловратки, рыбы.

Водоросли - основа пищевых цепей во всех природных экосистемах. Наиболее чувствительные организмы к широкой гамме химических веществ от детергентов до НФПР. Отмирание клеток, нарушение скорости роста, изменение процессов фотосинтеза и др. метаболич. процессов. Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, Anabaena, Microcystis, Oscillatoria, Phormidium.

Бактерии - изменение скорости разложения (биодеградации) органических соединений/ Nitrosomonas, Nitrosobacter; изменение метаболических процессов в организме - Escherichia coli (оценка влияния токсиканта на сбраживание глюкозы)

Простейшие. Дафнии. ДДТ, (ГХЦГ)гексахлорциклогексан, ТЯЖЕЛЫЕ металлы (медь-цинк-кадмий-хром), биогенные элементы. Daphnia magna.

Коловратки

Рыбы. Гуппи (Poecillia reticulata) - металлы, пестициды; данио (Brachidanio rerio).

Рыбы природных вод. Высокочувствительные: - лососевые (форель), шиповка, пескарь, плотва, голец, судак, верховка; среднечувствительные: окунь, красноперка, лещь, гольян, карп, уклея.

Токсичность вод

О наличии токсичности судят по проявлениям негативных эффектов у тест-объектов, которые считаются показателями токсичности.

Среди показателей токсичности выделяют: общебиологические, физиологические, биохимические, химические, биофизические, и т.д.

Показателем токсичности является тест-реакция, изменения которой регистрируют в ходе токсикологического эксперимента.

Следует заметить, что под токсикологическими (биотестовыми) показателями в экологической и водной токсикологии понимают показатели биотестирования на различных тест-объектах. В тоже время в санитарно-гигиеническом нормировании под токсикологическими показателями понимают концентрации токсичных химических веществ (например, в нормировании питьевой воды они характеризуют ее безвредность).

При биотестировании проб природной воды обычно ставят два вопроса: - токсична ли проба природной воды; - какова степень токсичности, если таковая имеется?

В результате биотестирования проб на основе регистрации показателей токсичности делают оценку токсичности по критериям, установленным для каждого биообъекта. Результаты биотестирования опытной пробы с исследуемого участка сравнивают с контрольной, заведомо нетоксичной пробой и по разнице в контроле и опыте судят о наличии токсичности.

При этом эффекты воздействия делят на острые и хронические. Их обозначают как острое и хроническое токсическое действие или как острую и хроническую токсичность (ОТД и ХТД). Эти термины и используют для выражения результатов биотестирования.

Острое токсическое действие - воздействие, вызывающее быструю ответную реакцию тест-объекта. Его чаще всего измеряют по тест-реакции «выживаемость» за относительно короткий период времени.

Хроническое токсическое действие - воздействие, вызывающее ответную реакцию тест-объекта, проявляющуюся в течение относительно долгого периода времени. Измеряют по тест-реакциям: выживаемость, плодовитость, изменение роста и т.п.

Реакция тест-объектов на токсическое воздействие зависит от интенсивности или продолжительности воздействия. По результатам биотестирования находят количественную зависимость между величиной воздействия и реакцией тест-объектов.

Реакция организмов на воздействие токсических химических веществ представляет собой комплекс взаимосвязанных эволюционно сформировавшихся реакций, направленных на сохранение постоянства внутренней среды организма и в конечном итоге на выживание.

Выявлены определенные закономерности реакций организмов на токсические воздействия. В общем виде воздействие токсического вещества на организм описывается двумя основными параметрами: концентрацией и временем воздействия (экспозицией). Именно эти параметры определяют степень влияния токсичного вещества на организм.

Экспозиция - период, в течение которого организм находится под воздействием исследуемого фактора, в частности химического вещества. В зависимости от экспозиции различают острое или хроническое токсическое воздействие.

Результат токсического воздействия обычно называют эффектом токсического воздействия. Для описания зависимости между эффектом воздействия токсического вещества на организм и его концентрацией предложены различные функции, например, формула Хабера:

Где Е - эффект (результат) воздействия;

С - концентрация воздействующего вещества;

Т - время воздействия (экспозиция).

Е - представляет собой любой результат воздействия (гибель тест-объектов), а величины С и Т - могут быть выражены в соответствующих единицах измерения.

Как видно из формулы Хабера, между эффектом временем воздействия концентрацией имеется прямая функциональная связь: эффект будет тем большим, чем больше величина воздействия (конц-ция вещ-ва) и/или его продолжительность.

Формула Хабера позволяет сравнивать биологические эффекты различных химических веществ с помощью анализа их конц-ции или экспозиции. Отличия по какому-либо из этих величин отражают отличия в чувствительности организмов к токсическому воздействию.

При малых конц-циях или экспозициях эффект воздействия проявляется в популяции у небольшого числа тест-объектов, которые оказываются наиболее чувствительными, т.е. наименее устойчивыми к воздействию. По мере увеличения концентрации или экспозиции число устойчивых организмов падает, и в конце концов у всех (или почти у всех) организмов удается зарегистрировать четко выраженные эффекты токсического воздействия. В ходе токсикологического эксперимента находят зависимость отклика тест-объектов от величины или времени воздействия.

Параметры токсичности химического воздействия:

Летальная концентрация (ЛК50) - концентрация токсиканта, вызывающая гибель 50% тест-организмов за определенное время (чем ниже ЛК50, тем выше токсичность химического вещества или воды)

Максимальная недействующая концентрация - наивысшая измеренная концентрация химического вещества (тестируемой воды), не вызывающая наблюдаемого химического воздействия (чем ниже МНК, тем выше токсичность хим. вещ-ва или сточной воды).

Не все организмы одинаково реагируют на одно и то же воздействие. Реакция зависит от чувствительности к возд-вию.

Чувствительность организма к токсичному веществу - это совокупность реакций на его воздействие, характеризующих степень и скорость реагирования организма. Характеризуется такими показателями, как время начала проявления отклика (реакции) или конц-ция токсического вещ-ва, при которой проявляется реакция; она существенно отличается не только у разных видов, но и у разных особей одного вида.

Согласно ряду чувствительности, разработанному С.А. Патиным (1988), тест объекты можно расположить следующм образом:

Рыбы-зоопланктон-зообентос-фитопланктон-бактерии-простейшие-макрофиты.

Существуют и другие ряды чувствительности.

Например, при биотестировании вод целлюлозно-бумажных предприятий: водоросли-бактерии-рыбы (по уменьшению чувствительности).

Факторы, влияющие на биотестирование:

Факторы, влияющие на тест-организмы (экспозиция; условия культивирования, в природе - условия жизни растений и животных; возрастные особенности, сезон года, обеспечение тест-организмов пищей, температура (пессимум и оптимум), освещенность);

Факторы, определяющие физико-химические свойства тестируемой природной воды, от которых зависит ее токсичность для тест-организмов (свежесть пробы, наличие в ней взвешенных частиц).

2. Методы биотестирования на различных группах организмов для оценки качества природных и сточных вод

Рассмотрим основные методики определения острого токсического действия вод при кратковременном биотестировании на ракообразных, водорослях и инфузориях; метод определения хронического токсического действия вод на водорослях.

Способы обработки и оценки результатов биотестирования основаны на стандартных и широко используемых в отечественной и международной практике методах статистической обработки экспериментальных данных.

Прежде чем проводить эксперименты по биотестированию, нужно вырастить культуру тест-организмов.

Биотестирование на ракообразных

Методика предназначена для определения острой токсичности природной и сточной воды, сбрасываемой в водоемы.

1. Принципы культивирования рачков Daphnia magna Straus и Ceriodaphnia affinis Lilljeborg

Период созревания Daphnia magna до вымета молоди при оптимальной температуре и хорошем питании занимает 5-10 суток. Продолжительность жизни 110-150 суток, при температурах свыше 25 °С она может сокращаться до 25 суток.

При оптимальных условиях содержания партеногенетические поколения следуют одно за другим каждые 3-4 суток. У молодых дафний число яиц в кладке 10-15, затем оно возрастает до 30-40 и более, снижаясь до 3-8 и до 0 за 2-3 суток до смерти.

Культуру дафний выращивают в термостатируемом при 18-22 °С люминостате (освещенность 400-600 люкс, продолжительность светового дня 12-14 часов). Опыты по биотестированию вод желательно проводить в том же люминостате.

Для получения исходного материала для биотестирования 30-40 самок с выводковыми камерами, полными яиц или зародышей, за 1 сутки до биотестирования пересаживают в емкости объемом 0,5-2 л. После появления молоди их отделяют от взрослых особей с помощью капроновых сит с разным диаметром пор.

Принципы культивирования цериодафний аналогичны описанным для дафний. Следует помнить, что цериодафнии более требовательны к содержанию кислорода в воде (не менее 5 мг/л), оптимальная температура культивирования 23-27°С. Период созревания рачков от рождения до момента вымета молоди короче, чем у дафний - от 4 до 5 суток.

При биотестировании важно учитывать следующие моменты:

Молодь рачков в 4-5 раз более чувствительна к действию токсикантов, чем взрослые особи.

Кормление рачков во время острого опыта уменьшает токсичность примерно в 4 раза.

В мягкой воде токсичность веществ повышается. Ионы магния обычно уменьшают токсичность солей, ионы кальция - снижают токсичность.

Присутствие комплексообразующих веществ (гуминовые кислоты, аминокислоты и т.п.) увеличивает накопление токсикантов, но снижает их токсичность.

Дефицит кислорода в воде ускоряет накопление токсических веществ в водной среде.

Солнечный свет увеличивает токсичность в основном за счет возрастания количества свободных радикалов.

Определение устойчивости Daphnia Magna Straus к бихромату калия

Прежде всего необходимо оценить пригодность лабораторной культуры дафний для последующего биотестирования вод. Эталонным токсикантом служит бихромат калия.

Стакан емкостью 100-250 мл (21 штука).

Пипетки мерные на 1, 10, 25 мл 2-го класса точности (по 1 штуке). Колба для разбавляющей (контрольной) воды (РВ) емкостью 3 л. Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), на 250 мл (1 шт.), на 500 мл (2 шт.), на 1000 мл (1 шт.).

210 рачков в возрасте 4-24 часа. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.

Приготовить 100 мл 0,1% раствора К 2 Сr 2 О 7 (1000 мг/л).

Для этого 0,1 г просушенного К 2 Сr 2 О 7 растворить в 100 мл дистиллированной воды.

Расставить 21 стакан с надписями по следующей схеме:

К1 0,25 мг/л 0,5 мг/л 0,75 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 3 мг/л

К2 0,25 мг/л 0,5 мг/л 0,75 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 3 мг/л

КЗ 0,25 мг/л 0,5 мг/л 0,75 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 3 мг/л

Посадка рачков

Во все стаканы с растворами посадить по 10 рачков в возрасте строго 4-24 часа. Посадку производить с помощью микропипеток со съемными пластиковыми наконечниками. Концы наконечников предварительно необходимо обрезать под величину дафнии одно-двухдневки.

Эксперимент

Подсчет выживших рачков производят визуально через 24 часа. Во время опыта рачков не кормят. Смертность рачков в контроле не должна превышать 10%. Результаты заносят в протокол опыта.

3. Определение токсичности сточной (природной) воды на Daphnia magna

Материалы

Стаканы емкостью 150-250 мл (8-16 штук).

Колба для разбавляющей (контрольной) воды емкостью 3 л.

Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), 1 л (1 шт.).

Мерный цилиндр или мерный стакан на 150-200 мл.

От 40 до 80 рачков в возрасте 4-24 часа. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.

Подготовка опыта

Расставить 16 стаканов с надписями по следующей схеме:

К1 Ст.вода б/р N 1 Ст.вода 1:10 N 5 Ст.вода 1:100 N 9

К2 Ст.вода б/р N 2 Ст.вода 1:10 N 6 Ст.вода 1:100 N 10

КЗ Ст.вода б/р N 3 Ст.вода 1:10 N 7 Ст.вода 1:100 N 11

К4 Ст.вода б/р N 4 Ст.вода 1:10 N 8 Ст.вода 1:100 N 12

Разлить по стаканам контрольную (разбавляющая вода) и испытуемую воду (ст.вода) по 150 мл на стакан:

К1-К4 - 600 мл разбавляющей воды (РВ),

Ст.вода б/р (без разбавления) - 600 мл (4 х 150 мл).

Ст.вода 1:10 - 100 мл Ст.воды б/р + 900 мл РВ = 1 л Ст.вода 1:10.

Ст.вода 1:100 - 100 мл Ст.воды 1:10 + 900 мл РВ = 1 л Ст.вода 1:100

Стаканы с растворами расставить в люминостате.

В обязательном порядке скорректировать рН проб до 6,5-8,5 с помощью растворов NaOH или НСl, если они не соответствуют указанным выше нормативам.

Насыщенность тестируемых проб кислородом также должна лежать в указанных рамках.

Посадка рачков

Во все стаканы посадить по 5 рачков в возрасте строго 4-24 часа.

Эксперимент

Подсчет погибших рачков производят визуально через 1, 6, 24, 48, 72, 96 часов (окончание определения острой токсичности). Смертность рачков в контроле не должна превышать 10%.

Результаты заносят в протокол опыта.

Биотестирование прекращают, если в любой период времени в опыте гибнет 50% и более особей.

Если А >= 50%, то тестируемая вода (опыт) остротоксична.

Если А < 50%, то тестируемая вода не оказывает острого токсического действия.

Для более точного определения острой токсичности строят график, где по оси абсцисс (ось X) откладывают время в часах, а по оси ординат (ось Y) смертность в процентах к контролю (А). Из графика находят ЛТ50 - время, в течении которого погибает 50% дафний.

Определение токсичности сточной (природной) воды на Ceriodaphnia affinis

Материалы

Пробирки емкостью 20 мл (20-40 штук).

Колба для разбавляющей (контрольной) воды емкостью 1 л.

От 40 до 80 рачков в возрасте 0,1-8 часов. Разница в возрасте рачков не должна превышать 4 часов.

Подготовка опыта

Расставить пробирки по 10 штук в ряду по следующей схеме:

К1 Ст.вода б/р N 1 Ст.вода 1:10 N 1 Ст.вода 1:100 N 1

К2 Ст.вода б/р N 2 Ст.вода 1:10 N 2 Ст.вода 1:100 N 2

К3 Ст.вода б/р N 3 Ст.вода 1:10 N 3 Ст.вода 1:100 N 3

К4 Ст.вода б/р N 4 Ст.вода 1:10 N 4 Ст.вода 1:100 N 4

К5 Ст.вода б/р N 5 Ст.вода 1:10 N 5 Ст.вода 1:100 N 5

К6 Ст.вода б/р N 6 Ст.вода 1:10 N 6 Ст.вода 1:100 N 6

К7 Ст.вода б/р N 7 Ст.вода 1:10 N 7 Ст.вода 1:100 N 7

К8 Ст.вода б/р N 8 Ст.вода 1:10 N 8 Ст.вода 1:100 N 8

К9 Ст.вода б/р N 9 Ст.вода 1:10 N 9 Ст.вода 1:100 N 9

К10 Ст.вода б/р N 10 Ст.вода 1:10 N 10 Ст.вода 1:100 N 10

Разлить по пробиркам контрольную (разбавляющая вода) и сточную воду (Ст.вода) по 15 мл:

К1-К10 - 150 мл разбавляющей воды (РВ).

Сточная вода б/р (без разбавления) - 150 мл (10 * 15 мл).

Сточная вода 1:10 - 25 мл Ст.воды б/р + 225 мл РВ = 250 мл Ст.вода 1:10.

Сточная вода 1:100 - 25 мл Ст.воды 1:10 + 225 мл РВ = 250 мл Ст.вода 1:100.

Пробирки с растворами расставить в люминостате.

Произвести замеры температуры в люминостате (норма 23-27°С), рН растворов (норма 6,5-8,5), концентрация растворенного кислорода (норма перед началом опыта 6 мг/л, в конце опыта - не менее 4 мг/л).

В обязательном порядке скорректировать рН проб до 6,5-8,5 с помощью растворов NaOH или НСl, если они не соответствуют указанным выше нормативам. Насыщенность тестируемых проб кислородом также должна лежать в указанных рамках.

Режим освещения в люминостате - 12-часовой с интенсивностью 400-600 люкс.

Посадка рачков

Во все пробирки посадить по 1 рачку в возрасте 0,1-8 часов. Разница в возрасте рачков не должна превышать 4 часа.

Эксперимент

Подсчет погибших рачков производят визуально через 1, 6, 24, 48 часов (окончание определения острой токсичности). Во время опыта рачков не кормят. Результаты заносят в протокол опыта.

Обработка результатов выполняется аналогична предыдущим.

4. Биотестирование с использованием водоросли

Scenedesmus quadricauda

Методика предназначена для определения токсичности природных и сточных вод.

Общие принципы культивирования микроводорослей

Эффективное культивирование одноклеточных зеленых водорослей в лаборатории определяется в основном наличием минеральных элементов в питательной среде, достаточно интенсивным освещением (2000-3000 люкс) и определенной температурой (18-20 °С).

Лучшей средой для выращивания зеленых водорослей для токсикологических является питательная среда Успенского N 1, которая содержит более низкую общую концентрацию солей.

Все манипуляции со средой Успенского N 1 при работе с водорослью Scenedesmus проводятся при строгом соблюдении условий стерильности.

Недопустимым является совместное культивирование данной водоросли с хлореллой в одном люминостате (хлорелла быстро засоряет и подавляет культуру сценедесмус).

Продолжительность опытов по выявлению токсичности вод может быть 4, 7, 14 и более дней в зависимости от поставленных задач. Максимальное накопление токсиканта в клетках водорослей отмечается, обычно, к исходу 3-4 суток, поэтому чаще всего определение острой токсичности ограничивают 4 сутками.

Если в результате биотестирования на острую токсичность выявлена достоверная стимуляция роста водорослей, то для окончательного суждения о токсичности пробы необходимо ставить хронический эксперимент (до 14 суток).

Достоверная стимуляция роста водорослей свидетельствует о наличии эвтрофирующего загрязнения, а достоверное угнетение роста водорослей - о наличии токсического загрязнения.

Подготовка культуры

В опыте использовать 5-10 суточную культуру, находящуюся в экспоненциальной фазе роста.

Перед посевом культуру сгущают одним из трех способов: - отстаиванием 2-3 дня, центрифугированием, фильтрованием через мембранный фильтр N 4 или фильтровальную бумагу с синей лентой. Полученная суспензия (концентрат) клеток используется для последующего посева.

Производится в большую опытную колбу емкостью 1,5 л, в случае биотестирования в колбах (по 100 мл) или в колбу емкостью 150 мл при биотестировании в пенициллиновых пузырьках (по 10 мл). Обычно требуется примерно 30 мкл суспензии на 30 мл воды.

В опытных колбах после посева должно быть около 200-300 тысяч клеток водорослей в 1 мл (не более 500 тысяч/мл) - едва заметное зеленоватое окрашивание на белом фоне.

Из большой колбы произвести разлив культуры по колбам (3 повторности по 100 мл) или пенициллиновым пузырькам (3 повторности по 10 мл).

5. Оценка результатов опыта по определению устойчивости культуры к бихромату калия

Подсчет производят с помощью микроскопа (например, типа "Биолам") при 80-100 кратном увеличении.

Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева или Фукс-Розенталя. Камеру и относящееся к ней покровное стекло обезжиривают, покровным стеклом накрывают камеру и притирают его до образования радужных колец интерференции. Из каждой колбы пипеткой наносят по одной капле тщательно перемешанной суспензии на верхний и нижний края покровного стекла. Камеру заполняют так, чтобы не образовывались пузырьки воздуха, избыток суспензии вытесняется по канавкам. Просматривают 16 квадратов по диагонали или все поле камеры в случае малой численности водорослей (при одном заполнении камеры просчитывают не менее 50 клеток).

Из каждой колбы просматривают не менее трех проб.

Оценка токсического действия химического соединения или тестируемой воды делается на основании достоверности различий между показателями численности клеток водорослей в контроле и в опыте.

При этом вычисляют:

а) средние арифметические величины численности клеток - Xi и X (из двух и шести подсчетов, соответственно).

б) численность клеток в процентах от контроля. Сумма (X - Xi)

в) среднее квадратичное отклонение (б):

где n - количество повторностей; в данном случае (см. табл.3.1) n = 3;

в) ошибку среднего арифметического (X): S = б/корень из n;

г) Td - критерий достоверности различий двух сравниваемых величин:

где Xk и Хо - сравниваемые средние величины (в контроле и опыте),

Sk - So - квадраты ошибок средних в контроле и опыте.

Td рассчитывают на каждые сутки и сравнивают с табличной величиной Tst - стандартным значением критерия Стьюдента.

Принимают уровень значимости Р = 0,05 и степень свободы (n1 + n2 - 2), т.е. (3 + 3 - 2) = 4.

Tst при степени свободы 4 равно 2,78.

Если Td больше или равно Tst, то различие между контролем и опытом достоверно - тестируемая вода загрязнена (токсическое или эвтрофирующее загрязнение)

Если Td меньше Tst, то различие между контролем и опытом не достоверно - тестируемая вода не загрязнена.

Для расчетов Td можно использовать калькуляторы типа МК-51 и МК-71, а также компьютерные электронные таблицы (например, программу "Сигма" ЦСИАК), что значительно ускоряет работу.

Для графического представления результатов биотестирования по оси абсцисс откладывают время в сутках, а по оси ординат либо число клеток водорослей в 1 мл, либо число клеток водорослей в процентах от контроля.

6. Определение устойчивости Scenedesmus quadricauda к действию бихромата калия

Добавить последовательно в 30 мл дистиллированной воды (контроль) 30 мкл KNO 3 , 30 мкл MgSO 4 , 30 мкл Ca(NO 3) 2 , 30 мкл КН 2 РО 4 , 30 мкл К 2 СО 3 .

Хронический опыт (в пузырьках)

На 7-е сутки биотестирования проводят смену контрольной и тестируемой воды в стерильных условиях. При этом в новую партию пузырьков наливают по 7,5 мл контрольной и тестируемой воды. Затем в пузырьки добавляют по 0,01 мл (10 мкл) каждого из 5 маточных растворов солей и по 2,5 мл старой культуры из пузырьков, в которых проводилось биотестирование в остром опыте. Подсчет численности клеток проводят на 7-е, 10-е и 14-е сутки.

На практике бывает удобно использовать таблицу оценки результатов биотестирования по 5-бальной шкале (таблица 3.3).

Необходимо помнить, что увеличение биомассы водорослей может быть связано с наличием эвтрофирующих загрязнений в испытуемой воде, в этом случае о наличии токсического эффекта можно судить после испытания на нескольких тест-объектах.

7. Биотестирование на инфузориях

В основу метода положен один из вариантов определения острой токсичности воды по выживаемости инфузорий Paramecium caudatum.

Используется:

Для определения токсичности сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения, что позволяет проводить технологическую корректировку режима подготовки и очистки сточных вод;

Для определения токсичности локальных потоков сточных вод, что позволяет выяснять их взаимодействие, определять вклад каждого потока в токсичность сточных вод отдельного предприятия, суммарную токсичность сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения;

Для определения токсичности водных растворов отдельных веществ и их смеси.

Принцип методики

Методика определения острой летальной токсичности сточной воды по выживаемости инфузорий основана на установлении количества погибших или обездвиженных особей после экспозиции в тестируемой воде. Критерием острой летальной токсичности является гибель или обездвиживание 50% и более особей в течение 1 часа в тестируемой воде по сравнению с их исходным количеством.

Тестовый организм

В качестве тест-объекта используют лабораторную монокультуру Paramecium caudatum Ehrenberg.

Paramecium caudatum - одноклеточные организмы размером 180-300 мкм. Тело сигарообразной или веретенообразной формы, покрытое плотной оболочкой (пелликулой).

Paramecium caudatum - массовый вид в пресной воде с высоким содержанием органических веществ. В сточной воде является часто основным видом, поли-альфа-мезосапроб. Простейшие, в том числе ресничные инфузории, составляют основную часть микрофауны активного ила. Они участвуют в освобождении очищаемой воды от взвешенных бактериальных клеток и от рыхлых, плохо оседающих бактериальных агломератов, способствуя тем самым повышению эффективности очистки.

Выделение и культивирование

Выделение из активного ила. Наиболее подвижную и крупную особь отлавливают из пробы активного ила очистных сооружений и переносят в микроаквариум со стерильной водопроводной водой.

Путем последовательного переноса этой особи из лунки в лунку добиваются отделения ее от других простейших и цист. Затем помещают отмытую инфузорию в пробирку со средой культивирования.

Через 7-8 суток из полученной таким образом монокультуры одну наиболее крупную и подвижную особь вновь переносят в свежую среду.

Спустя 8-10 суток культуру можно использовать для определения токсичности.

Культивирование инфузорий на молоке. Культуру парамеций выращивают на дехлорированной водопроводной воде, которую добавляют разбавленное в 20 раз такой же водой пастеризованное молоко. Пересевают культуру инфузорий один раз в месяц (при необходимости один раз в три недели).

Материалы и оборудование

Подсчет Paramecium caudatum производят с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9, МБС-10 или иного, обеспечивающего 8-24 кратное увеличение. Конструкция микроаквариумов из прозрачного органического стекла приведена на рис.1. Для разбавления и внесения одинакового количества исследуемой пробы используют стандартные стеклянные пипетки.

Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора, при невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают (+4°С).

Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов.

В качестве контрольной используют водопроводную воду, которую дехлорируют путем отстаивания и аэрирования с помощью микрокомпрессора в течение 7 суток.

Для определения токсичности отдельных веществ или их смеси из них готовят растворы путем добавления определенных количеств маточного раствора, исследуемого(ых) вещества(в) в водопроводную дехлорированную воду. Маточные растворы готовят на дистиллированной воде.

При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре культуры.

При наличии в пробе крупнодисперсных взвесей необходима фильтрация.

При проведении биотестирования значения рН тестируемых растворов должно находиться в интервале от 6,5 до 7,6.

Биотестирование проводят в помещении, не содержащем вредных паров и газов, при рассеянном свете и температуре воздуха 18-28°С.

Проведение биотестирования

Для биотестирования неразбавленной сточной воды или ее разбавлений, а также растворов отдельных токсических веществ (смеси веществ) используют микроаквариум с лунками, который помещают на предметный столик стереомикроскопа.

Одну из лунок заполняют культурой инфузорий с помощью капиллярной пипетки.

В свободные лунки капиллярной пипеткой рассаживают по 10-12 особей в каждую лунку, так чтобы на одну пробу тестируемой воды приходилось не менее 30 инфузорий в трех лунках (трехкратная повторность).

При посадке тест-объекта количество культуральной жидкости в лунке не должно превышать 0,02 мл.

Три лунки используют в качестве контрольных.

После посадки инфузорий наливают в контрольные лунки по 0,3 мл дехлорированной водопроводной воды, в опытные - по 0,3 мл пробы тестируемой воды. Отмечают время начала биотестирования и подсчитывают под микроскопом количество особей в каждой лунке.

Микроаквариум с заполненными лунками помещают в чашку Петри, на дно которой кладут фильтровальную бумагу, смоченную водой, чтобы не испарялось содержимое лунок, и выдерживают в течение 1 часа при температуре 22-24°С. По истечении этого времени производят подсчет выживших особей под микроскопом. Выжившими считаются инфузории, которые свободно перемещаются в толще воды. Обездвиженных особей относят к погибшим. Результаты подсчета записывают в рабочий журнал.

Результаты биотестирования считаются правильными и учитываются, если гибель инфузорий в контрольных лунках не превышала 10%.

После подсчета особей в каждой из трех лунок находят среднее арифметическое количество инфузорий, выживших в тестируемой воде.

Тестируемую воду оценивают как оказывающую острое летальное действие, если в течение 1 ч в ней гибнет 50% и более инфузорий.

При определении острой летальной токсичности разбавлений пробы сточной воды или водного раствора отдельного вещества (смеси) устанавливают среднюю летальную кратность разбавлений (среднюю летальную концентрацию), вызывающую гибель 50% тест-объектов в течение 1 часа - ЛКр 50 - 1 ч (ЛК 50 - 1 ч).

Для построения графика с целью расчета ЛКр 50 - 1 ч (ЛК 50 - 1 ч) тест-параметр выражают в условных единицах - пробитах, а кратность разбавления (концентрацию) - в логарифмических величинах.

На оси абсцисс откладывают логарифмы концентраций кратности разбавлений сточной воды (концентраций вещества), на оси ординат величины тест-параметра в пробитах. Полученные точки соединяют прямой.

Из точки на оси ординат, соответствующей 50% гибели тест-объекта, проводят линию, параллельную оси абсцисс до пересечения с линией графика.

Из точки их пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс и находят логарифмы ЛКР 50 - 1 ч.

Величину найденного логарифма переводят в величину кратности разбавления (концентрацию, выраженную в мг/л вещества).

Результаты биотестирования представляют в виде протокола.

После проведения биотестирования микроаквариумы промывают водой (температура не выше 40°С), протирают ваткой, смоченной в спирте, промывают дистиллированной водой.

Оценка токсичности воды с использованием биотеста на водорослях.

По формуле рассчитаем коэффициент прироста численности водорослей за 96 ч (4 сут).

M= 10 3 ,

где M - численность клеток водорослей, тыс.кл./мл;

m - число подсчитанных клеток;

n - число просчитанных маленьких квадратов камеры;

V - объем части камеры, соответствующей площади маленького квадрата, мл.

8. Оценка токсичности воды с использованием экспресс-биотеста на коловратках

Для определения возможного острого токсического действия исследуемой воды проводим эксспресное биотестирование на массовой культуре коловраток.

Для оценки токсического действия исследуемой воды используем средние данные о СОС (показатель скорости осветления среды). Рассчитаем СОС для опыта по формуле (2).

биотестирование вода токсичность калий

СОС =[(C 0 - C t)/(C 0 N t)]V,

где СОС - показатель скорости осветления среды, мкл/(экз. . мин);

C 0 и C t - число клеток водорослей в одном большом квадрате камеры Горяева в начале и конце биотестирования соответственно;

N - число коловраток в микроаквариуме;

t - время биотестирования, мин;

V - объем воды в микроакварему, мкл.

Литература

1. Бакаева Е.Н., Никаноров А.М. Гидробионты в оценке токсичности вод суши. М.: Наука, 2006. 257 с.

2. Бакаева Е.Н. Определение токсичности водных сред. Методические рекомендации. Ростов-на-Дону: Эверест 1999. 48 с.

4. Никаноров А.М., Хоружая Т.А., Бражникова Л.В., Жулидов А.В. Мониторинг качества вод: оценка токсичности. - С-Пб.: Гидрометеоиздат, 2000, с. 10- 15, 39-42.

5. Бакаева Е.Н. Эколого-биологические основы жизнедеятельности коловраток в культуре. Ростов-на-Дону: СКНЦ ВШ, 1999. 51 с.

6. Бакаева Е.Н. Возможность обеспечения гарантий качества информации с использованием методик биотестирования на коловратках // Научная мысль Кавказа. 1999 № 5. С. 26-36

7. Бакаева Е.Н., Макаров Э.В. Эколого-биологические основы жизнедеятельности коловраток в норме и в условиях антропогенной нагрузки. Ростов-на-Дону: СКНЦ ВШ, 1999. 206 с.

9. Никаноров А.М., Хоружая Т.А., Бражникова Л.В., Жулидов А.В. Мониторинг качества вод: оценка токсичности. - С-Пб.: Гидрометеоиздат, 2000, С. 16-39.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

Методы биоиндикации по водорослям и биотестирования по Lepidium sativum L. Видовой состав водорослей и цианобактерий в сточных водах МУП "Уфаводоканал". Исследование количественного развития водорослей и цианобактерий в загрязненной и очищенной воде.

дипломная работа , добавлен 09.06.2014


Классификация сточных вод и методы их очистки. Качественный и количественный учет водорослей и цианобактерий. Методика определения токсичности воды по показателям кресс-салата (Lepidium sativum L.). Биотетстирование сточных вод МУП "Уфаводоканал".

дипломная работа , добавлен 06.06.2014


Состав сточных вод пищевой промышленности. Оценка влияния сточных вод пищевой промышленности на состояние природных вод, на животный мир водоемов. Правовые основы и методы обеспечения природоохранного законодательства в области охраны природных вод.

дипломная работа , добавлен 10.08.2010


Влияние воды и растворенных в ней веществ на организм человека. Санитарно-токсикологические и органолептические показатели вредности питьевой воды. Современные технологии и методы очистки природных и сточных вод, оценка их практической эффективности.

курсовая работа , добавлен 03.01.2013


Особенности использования методов биотестирования и биоиндикации для мониторинга состояния окружающей среды. Контроль качества природных и сточных вод на биоиндикаторе Daphnia magna Strauss. Чувствительность индикатора к различным химическим препаратам.

дипломная работа , добавлен 06.10.2009


Предназначение и основные методы биологической очитки воды. Важность качественной очистки сточных вод для охраны природных водоемов. Деградация органических веществ микроорганизмами в аэробных и анаэробных условиях, оценка преимуществ данного метода.

реферат , добавлен 14.11.2010


Повторное использование сточных вод как гигиеническая проблема. Биологическое и химическое загрязнение сточных вод. Методы обезвреживания сточных вод и проблемы безопасности использования восстановленной воды. Экологическая оценка применения осадка.

курсовая работа , добавлен 27.12.2009


Проблема обращения с отходами производства и потребления. Исследование методик проведения биотестирования. Оценка тест-объектов. Целесообразность установления класса опасности отходов методом биотестирования для ЗАО "Тролза" с экономической точки зрения.

презентация , добавлен 21.06.2012


Источники загрязнения внутренних водоемов. Методы очистки сточных вод. Выбор технологической схемы очистки сточных вод. Физико-химические методы очистки сточных вод с применением коагулянтов. Отделение взвешенных частиц от воды.

реферат , добавлен 05.12.2003


Очистка и обесцвечивание природной воды коагулянтами и флокулянтами. Условия применения флокулянтов для очистки воды. Методы определения показателей качества питьевой воды. Исследование флоккулирующих свойств новых сополимеров акриламида в воде.

В качестве тест-объектов в водной токсикологии широко используются планктонные ветвистоусые ракообразные (Cladocera), в частности дафнии (лат. Daphnia).

Это обусловлено прежде всего тем, что:

Род Daphnia имеет очень широкое распространение в пресных водах и является ключевым звеном во многих водных пищевых цепях;

Вследствие прозрачности тела дафний, есть возможность визуального наблюдения за качеством эмбрионов, скоростью их созревания, темпом размножения, а также оценки физиологического состояния (сердцебиения, наполнения кишечника и т.д.) тест-объекта;

Есть возможность регулярной оценки народившейся молоди по ее морфологическим признакам, а также по выживаемости от родительского к дочерним поколениям;

Род Daphnia имеет относительно короткий жизненный цикл, что особенно важно для тестов на плодовитость;

Род Daphnia используется как один из наиболее чувствительных индикаторов (датчиков) присутствия в водной среде тяжелых металлов и фосфорорганических пестицидов .

Наиболее универсальным тест-объектом по чувствительности и адекватности реагирования на различные токсиканты признан вид Дафний - Daphnia magna Straus .

Рис.2.

Впервые этот вид Daphnia как тест-объект был использован в работе Э.Наумана в 1933 году. Дафнии широко применяются в биотестировании в таких странах мира, как США, Германия, Франция, Венгрия и др. Во многих из них дафния принята как стандартный тест-организм. В СССР начало подобных работ связано с исследованиями Н.С. Строгонова и его школы, Е.А. Веселова и Л.А. Лесникова. Дафнии как обязательный тест-объект включены в схему установления ПДК веществ-загрязнителей и сточных вод России .

Daphnia magna Straus имеет серо-желтую или красноватую окраску (при дефиците кислорода), не превышает 2-3 мм в длину, обитает в водоёмах, прудах, озерах почти повсеместно.

При благоприятных условиях в лаборатории дафнии большую часть года размножаются без оплодотворения, т.е. партерогенетически, производя потомство, состоящее из самок. Период созревания рачков при температуре 20±2 оС и хорошем питании - 5-8 дней. Длительность эмбрионального развития обычно 3-4 дня. По истечении этого времени происходит вымет молоди. Партеногенетические поколения следуют одно за другим каждые 3-4 дня .

Для культивирования дафний используется биологизированная вода из аквариума, кормом служат зеленые водоросли (хлорелла). Культуру выращивают в специальном климостате при температуре 20±2 оС и освещенности 400-600 лк при продолжительности светового дня 12-14 часов.

В токсикологических исследованиях на дафниях различают кратковременное (до 96 часов) и длительное (20 и более суток) биотестирование. Кратковременное биотестирование рассчитано на получение экспресс информации о состоянии проверяемого водоема, где основным показателем служит выживаемость гидробионта. Для более глубокого и тщательного исследования используют длительное биотестирование. Оно позволяет долговременный эффект действия токсикантов.

Большинство методов биотестирования с использованием дафний основывается на регистрации их смертности под воздействием загрязняющих веществ. Но еще до гибели тест-объектов токсиканты влияют на изменение их поведенческой активности. Под воздействием поллютантов у дафнии наблюдается либо резкое повышение двигательной активности, либо наоборот замедление. Таким образом фиксирование изменения плавательной активности дафний позволяет на ранней стадии определить токсичность воды.

Также было проведено несколько работ, в которых ставилось предположение, что траектория плавания дафнии является фрактальной структурой, а при внесении токсиканта фрактальная размерность меняется. (Shimizu, 2001).

Фрактал - математическое множество, обладающее свойством самоподобия, то есть однородности в различных шкалах измерения. Самоподобие является весьма общим свойством природных систем: бассейны крупных рек, пространственная структура колоний микроорганизмов и др. - обладают удивительной структурной универсальностью. Часто в этой связи говорят о фрактальности природных объектов. Термин «фрактал» и первые исследования с его использованием были проведены Бенуа Мандельбротом.

Фрактальная размерность - это мера геометрической сложности объекта. Следуя идее Мандельброта, фрактальную размерность можно определить методом подсчёта квадратов. Представим себе объект сложной формы, который сплошь покрыт квадратами, как миллиметровая бумага. Часть квадратов будет содержать элементы множества, другие квадраты будут пустыми. Число непустых клеток N зависит от формы объекта и от размеров квадратной ячейки E. Постулируется, что N пропорционально 1/ED (чем мельче решётка, тем больше непустых ячеек). Показатель степени D и является размерностью объекта. Например, для такой сплошной плоской фигуры, как круг, уменьшение размера решётки вдвое приведёт к увеличению количества непустых клеток в четыре раза (два в квадрате), потому что фигура обладает размерностью два. Для фрактала количество непустых клеток будет возрастать с несколько меньшим, дробным показателем степени. Описанная процедура не ограничивается математическими объектами или формами на плоскости. Аналогичным образом можно подсчитать фрактальную размерность реальных объектов, таких, как реки, облака, береговые линии, артерии или реснички, покрывающие стенки кишечника. Артерии человека, например, имеют фрактальную размерность порядка 2,7 .

Фрактальная размерность рассчитывается по формуле Каца и Георгия (1985):

FD= log (N)/ ,

где L - это общая длина плавательной траектории, D - это диаметр описанной траектории, N - количество сегментов.

В качестве токсиканта был использован пестицид Esfenvalerate. Представляет собой химическое действующее вещество пестицидов (пиретроид), используется в сельском и личных приусадебных хозяйствах для борьбы с вредными насекомыми.

Препараты на основе эсфенвалерата проявляют сильную поражающую активность как при наружном контакте, так и при попадании в пищеварительную систему членистоногих вредителей. Защита растений происходит также при помощи репеллентного, парализующего и антифидантного действия.

Препараты имеют достаточно длительный эффект последействия даже в условиях прямого солнечного освещения. Защитное действие длится около 15 дней.

Эсфенвалерат гидролитически устойчив. При попадании в водоем сохраняется в воде до 10 суток, при этом испарение не будет играть особой роли в его исчезновении. Лабораторные исследования показывают, что эсфенвалерат является весьма токсичным для водных организмов .

Значительное время контроль за загрязнением окружающей среды осуществлялся только физико-химическими методами, путем определения концентраций загрязнителей и соблюдением соответствия величин измеренных концентраций нормированных показателей предельно-допустимым концентрациям (ПДК). С развитием химической промышленности, синтезом новых соединений и их использованием в производстве перечень контролируемых загрязнителей в составе сточных вод увеличивается с каждым днем. Сегодня много загрязняющих веществ по разным причинам не контролируется: для одних не разработаны ПДК, для других отсутствуют утвержденные методики определения, а их воздействие испытывает окружающая среда. В результате поучается так, что широкий спектр соединений, токсичных веществ в водной, воздушной и почвенной средах не контролируется. Но и в случае контроля полного спектра соединений в среде на уровне ПДК нельзя утверждать об отсутствии вредного воздействия на окружающую среду. Так как информация физико-химических показателей не позволяет в принципе сделать вывод о совокупном воздействии загрязняющих веществ различной природы на живые организмы и степени их опасности.

Заполнить информационный аналитический вакуум о комбинационном воздействии загрязнителей признаны методы биотестирования. Особенность информации, получаемой с помощью методов биотестирования состоит в интегральном характере отражения всей совокупности свойств испытуемой среды с позиции восприятия ее живых объектом. И в отличии от физико-химических методов, посредством которых определяется валовое содержание того или иного загрязнителя, биотестовые методы анализа качества воды позволяют обнаружить физиологически активные формы соединений, влияющие на организм. Так, например, нет возможности разрабатывать ПДК веществ под различные значения рН среды, а именно изменение рН среды влечет за собой образование иных форм соединений, возможно более токсичных. Или же токсическое действие токсикантов усиливается в мягкой воде нежели чем в жесткой. А комплексное воздействие загрязнителей совсем непредсказуемо.

Изучено и выделены несколько вариантов воздействия токсикантов.

1. Антагонистическое воздействие токсикантов - возможно такое сочетание ионов в комбинации которых эффект токсичности будет меньше.

2. Аддитивный эффект - эффект токсичности суммы токискантов равен сумме эффектов токсичности.

3. Синергический эффект - неполное суммирование эффектов токсичности.

4. Сеисибилизационный эффект - комбинация токсикантов усиливает эффект токсичности.

Сегодня биотестовые методы, как необходимое дополнение к химическому анализу включены в стандарт по контролю качества вод различного назначения.

Принцип биотестирования сводится к регистрации изменения биомассы, выживаемости, плодовитости, а также физиологических или биохимических показателей тест-объекта в испытуемой среде.

В настоящее время в мире используется большое разнообразие тест-объектов: от одноклеточных водорослей, мхов и лишайников, бактерий и простейших микроорганизмов до высших растений, рыб и теплокровных животных.

В России в органах государственного аналитического контроля за качеством воды дафниевый тест рекомендован в качестве основного для контроля токсичности сточных вод и перспективного для оценки уровня токсического загрязнения природных вод. Дафниевый тест обязателен при установлении ПДК отдельных веществ в воде рыбохозяйственных водоемов.

Выбор тест-объекта определен следующим: 1) этот род ветвистоусых рачков распространен повсеместно в пресных водоемах, является важной составной частью зоопланктона, служит источником пищи молоди рыб; 2) легко культивируется в лабораторных условиях - испытания загрязняющих веществ можно проводить в течении года; 3) определяющая особенность -это то, что по характеру питания они являются фильтраторами и прокачивают большие объемы воды, отфильтровывая в качестве пищи бактерий и микроводоросли, поэтому, если в воде присутствует токсикант даже маленькой концентрации из-за объема отфильтрованной воды чувствительность тест-объекта высокая.

Дафниевый метод биотестирования основан на определении изменений выживаемости и плодовитости дафний при воздействии токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Выделяют кратковременное биотестирование - до 96 час. Позволяет определить острое токсическое действие испытуемой воды на дафний по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество особей, выживших в тестируемой воде или в контрольной за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50% и более дафний за период времени до 96 час. в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Длительное биотестирование - 20 и более суток - позволяет определить хроническое токсическое действие испытуемой воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости. Показателем выживаемости служит среднее количество исходных самок-дафний, выживших в течение биотестирования, показателем плодовитости - среднее количество молоди, выметанной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжившую исходную самку. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

Выше было упомянуто о большом количестве тест-объектов, использующих в биотестировании и это неслучайно. Дело в том, что различные организмы по разному реагируют на загрязнители. И задача природоохранных органов правильно оценить ситуацию и выбрать более чувствительный тест-объект.

Пример. Результаты биотеетироваиия сточных вод завода,
синтезирущего биологические активные соединения гербицидного
направления, могут быть различными в зависимости от выбранного тест-
обьекта. Дафниевый тест может показать отсутствие токсического
воздействия, а культура водорослей может почувствовать токсикант.
Почему? Дело в том, что предполагаемый токсикант, синтезируемые
гербициды являются ингибиторами процессов фотосинтеза у растений и
водорослей. Поэтому дафнии могут в кратковременном опыте зафиксировать
отсутствие острого токсического воздействия, а водоросли в случае
нарушения работы фотосинтетической цепи оперативно отреагируют на
загрязненность.

Поэтому в системе контроля за качеством сточных вод также рекомендованы водоросли: хлорелла и сцепедесмус. Критерием токсичности при биотестирозании с использованием водорослей служит достоверное снижение количества клеток в испытуемой воде по сравнению с контролем.

С целью быстрого получения информации о качестве воды используются экспресс методы биотестирования.

В Москве разработан и выпускается мелкими.партиями прибор "Биотоке". Устройство Биотоке - это портативный биолюминометр,

позволяет с помощью биосенсора "Эколюм", светящиеся бактерии, производить быстрое и объективное определение индекса обшей токсичности водных образцов, включая металлы, препараты бытовой химии и т.д. Результаты токсичности пробы воды получают через 10 мин.

В Санкт-Петербурге выпускается прибор Биотестер. В качестве тест-объекта используют одноклеточные микроорганизмы - инфузории туфелька. Этот метод основан на хемотаксической реакции организмов в ответ на загрязнитель, т.е. движение культуры в благоприятную зону. Данная тест-реакция - хемотаксис, является очень чувствительной к токсикантам определенной группы.

В России биотестирование проводят аналитические лаборатории органов природоохраны для определения токсичности сточной воды (происходят ли патологические изменения или гибель организмов, обусловленные присутствием в ней токсических веществ) на сбросе в водный объект, воды в контрольном и других створах водопользования с целью проверки соответствия качества воды нормативным требованиям:

Сточная вода на сбросе в водный объект не должна оказывать острого токсического действия, а вода в контрольном и других створах водопользования - хронического токсического действия на тест-объекты.

В соответствии с "Методическим руководством по биотестированию воды РД 118-02-90", биотестирование является дополнительным экспериментальным приемом для проверки необходимости корректировки величин ПДС по интегральному показателю "токсичность воды", который позволяет учесть ряд существенных факторов: наличие в сточной воде токсических веществ, неучтенных при установлении ПДС, вновь образованных соединений, метаболитов, различные виды взаимодействия химических веществ. Необходимость корректировки величин ПДС возникает в том случае, если при биотестировании воды из контрольного створа водного объекта установлено несоответствие ее качества требуемому нормативу: вода в контрольном створе водного объекта не должна оказывать хронического токсического действия на тест-объекты (дафний и цероидафний).

Для оценки бактериального загрязнения используются санитарно-бактериологические и гидробиологические показатели.

Микронаселение природных вод чрезвычайно разнообразно. Его качественный и количественный состав определяется в первую очередь составом воды. Для глубоко залегающих, очень чистых артезианских вод характерно почти полное отсутствие бактерий вследствие защищенности водоносного слоя от контакта с лежащими выше горизонтами.

Особенностью состава воды открытых водоемов является изменение его по сезонам года: сопровождающееся изменениями в количестве и видовом разнообразии микронаселения. Бактериальная загрязненность поверхностных источников обусловлена, главным образом, поступлением в водоемы поверхностного стока, содержащего органические, минеральные вещества и микроорганизмы, смываемые с площади водосбора, и сточных вод.

С позиций санитарной микробиологии оценка качества воды проводится
с целью определения ее санитарно-эпидемиологической опасности или
безопасности для здоровья-человека. Вода играет важную роль в передаче
возбудителей многих инфекций; главным образом кишечных. Т.к. через воду
получают распространение брюшной тиф, дизентерия, холера,
инфекционный гепатит и т.д.

Прямое количественное определение возбудителей всех инфекций для контроля за качеством воды неосуществимо в связи с многообразием их видов и трудоемкостью анализа. В практической санитарной микробиологии поэтому прибегают к косвенным методам, позволяющим определить потенциальную возможность заражения воды патогенными микроорганизмами.

Санитарно-бактериологическая оценка качества воды основана на определении двух основных показателей; микробного числа и числа бактерий группы СоН.

Первый показатель даст представление об общей обсемененности воды аэробными сапрофитами, поэтому часто называется общим счетом аэробных сапрофитов или (кратко) общим счетом. Микробное число определяют методом посева на стандартную среду - мясопептонный агар (МПЛ).

Аэробные сапрофиты составляют только часть общего числа микробов в воде, но являются важным санитарным показателем качества воды, так как между степенью загрязнения ее органическими веществами и микробным числом существует прямая зависимость. Кроме того, полагают, что чем выше микробное число, тем больше вероятность присутствия в воде патогенных микроорганизмов. Микробное число водопроводной воды не должно превышать 100. В природных водах этот показатель изменяется в очень широких пределах для разных водоемов и по сезонам года для одного и того же водоема. В чистых водоемах число аэробных сапрофитов может исчисляться десятками или сотнями, а в загрязненных и грязных водоемах составлять десятки тысяч и миллионы.

По второму показателю - числу бактерий группы СоН (кишечная палочка) оценивают возможное присутствие в воде патогенных микроорганизмов.

Бактерии группы СоН относятся к семейству энтеробактерий. Это неспороносные палочки, факультативные анаэробы, сбраживающие лактозу и глюкозу при температуре 37°С с образованием кислоты и газа и не обладающие оксидазной активностью. Они являются постоянными сожителями кишечника человека и животных: постоянно и в большом числе выделяются во внешнюю среду; дольше, чем патогенные микроорганизмы, сохраняют жизнеспособность в этой среде; более устойчивы к хлору, чем возбудители большинства инфекций. Именно эти свойства бактерий группы СоИ обусловили возможность их использования в качестве санитарно-показательных микроорганизмов. Наличие коли-форм в воде говорит о ее фекальном загрязнении, а их число позволяет судить о степени этого загрязнения. Для количественного определения коли-форм применяют фуксин-сульфитный агар (среда Эндо).

Анализ водопроводной и чистой природной воды проводят после предварительного концентрирования воды на мембранных фильтрах.

Результаты выражают в виде коли-индекса - числа бактерий в 1 л воды.

Иногда делают пересчет, определяя коли-титр - наименьший объем воды (в мл), содержащий одну кишечную палочку. Коли-титр = 1000/коли-индекс.

Коли-индекс водопроводной воды должен быть не более 3. Допустимый коли-индекс воды источников водоснабжения зависит от предполагаемого способа очистки. Если намечается только хлорирование воды, то коли-индекс воды в источнике не должен превышать 1000 при полной очистке воды - 10000.

В особых условиях по санитарно-эпидемиологическим показателям прибегают к определению в воде - энтерококков, энтеровирусов сальмонелл и проводят исследования воды на патогенную микрофлору.

Поверхностные источники водоснабжения помимо санитарно-бактериологических тестов характеризуются также данными гидробиологических наблюдений. Микроскопированием пробы воды определяется число клеток фито- и зоопланктона. Эти показатели существенно изменяются по сезонам - как по количеству организмов, так и по их видовому разнообразию.

В весенне-летний период интенсивного развития водорослей (цветения водоема) содержание фитопланктона в поверхностных водах может достичь 50 тыс. клеток в 1 мл. Летом зоопланктон отличается большим разнообразием и представлен низшими ракообразными, коловратками, личинками моллюсков. В воде могут оказаться и бентосные организмы: черви, личинки насекомых. В зимний период в воде встречаются, в основном, низшие ракообразные. Число организмов зоопланктона обычно выражают числом экземпляров в 1 м3 воды. В воде источников встречаются также организмы, видимые невооруженным глазом. Их число оценивают числом экземпляров в 1 м3. Для рек средней полосы европейской части нашей страны концентрация зоопланктона составляет 100- 10000 экз. в 1 м воды. Обычно их в несколько раз меньше, чем организмов зоопланктона.

В питьевой воде планктонные организмы, так же как организмы видимые невооруженным глазом, должны отсутствовать.

При оценке экологической ситуации необходимо учитывать токсичность как анализируемых групп загрязняющих веществ, так и продуктов их метаболизма. Некоторые поллютанты в природной среде под воздействием ультрафиолетового излучения, при смене кислотно-щелочных условий и т. п. могут образовывать вещества более токсичные по сравнению с исходными. Кроме того, часто за рамками аналитических исследований, в силу научно-методических сложностей изучения, остается комбинированный эффект загрязняющих веществ, проявляющийся в аддитивности, потенцировании и ингибировании действия. В связи с этим в дополнение к обычным методам химико-аналитического контроля, применяемым для решения задач определения источников загрязнения, оценки качества состояния окружающей среды или экологического мониторинга, эффективно использование методов биотестиро- вания.

Биотестированием называется метод определения степени токсического воздействия физических, химических и биологических факторов среды, потенциально опасных для живых организмов данной экосистемы. Биотестироваиие осуществляется экспериментально в лабораторных или в естественных условиях путем регистрации изменения биологически значимых показателей исследуемых природных или природно-техногенных объектов с последующей оценкой их состояния в соответствии с выбранными критериями токсичности. По сути, биотестирование - это определение токсичности пробы (воды, почвы, донных осадков и т. д.) для данной культуры организмов в экспериментальных условиях.

Тест-объектами (организмами) могут быть бактерии, дрожжи, простейшие, водоросли, пиявки, моллюски, рыбы и т. д. Кроме того, наравне с целостными организмами в качестве тест-объектов выступают отдельные органы, ткани или клетки. Биотест ставится па определение общей токсичности, па мутагенность и канцероген- ность. В первом случае фиксируются показатели гибели организмов, морфологические нарушения, морфофункциональные изменения и отклонения в их поведении и двигательной активности. Изучение мутагенности и каицерогеииости проводится посредством кратковременных тестов по фиксации хромосомных повреждений, генных мутаций и повреждений ДНК с оценкой опасности вещества. Метод биотестирования иногда рассматривается в качестве альтернативы системе предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ в различных компонентах окружающей среды, что, по мнению ряда исследователей (Опекунов, 2014), по своей научно-методической сути является мало обоснованным.

Воздействие па тест-объект может осуществляться посредством имитации всех возможных путей поступления вредного вещества в организм. Основными тестируемыми средами являются вода, реже атмосферный воздух. Возможно также изучение опосредованного воздействия на тест-объект твердых компонентов окружающей среды: почв, дойных осадков, грунтов. В этом случае используют поровые воды этих сред или водные вытяжки из них, получаемые с использованием общепринятых методик. Кроме того, биотесты могут проводиться в фазе взвешенных частиц. Однако основным объектом применения методов биотестироваиия являются все же сточные и природные воды.

В последние годы методы биотестироваиия стали активно применяться при оценке качества морской среды. В первую очередь это связано с масштабным освоением нефтеуглеводородных ресурсов континентального шельфа и материкового склона Мирового океана. Тесты направлены па оценку качества морской среды, а также токсичности промышленных и буровых вод и буровых шламов. При этом наиболее сложной проблемой тестирования морской среды остается выбор тест-объектов, которые в уже сложившейся практике биологического контроля представлены в основном пресноводными формами организмов. Поэтому в настоящий период при проведении биотестироваиия морской среды предпочтение отдается видам, естественно обитающим па данных акваториях.

В основе методики биотестироваиия лежит сравнение тестируемых образцов с контрольными пробами в течение определенного времени. При этом могут проводиться экспериментальное биотестироваиие (до нескольких часов), оценка острого токсического воздействия (в течение 1-3 суток экспозиции), хронического токсического воздействия (через 7-10 суток экспозиции), а также прогноз отдаленных последствий (через 2-3 педели экспозиции). Всего к настоящему времени разработано более 50 стандартов.

Наиболее часто используемым тест-объектом является рачок Daphnia тадпа , который применяется при контроле токсичности сточных вод и выявлении источников загрязнения. Широкую апробацию получили тесты на поведенческие и физиологические реакции рыб (метод рыбной пробы), в частности на реакцию ухода рыбы из опасной зоны. В качестве показателей токсичности среды используются также изменения двигательной функции пиявок, реакции закрытия створок моллюсков, скорости потребления кислорода голотурией и др.

Для определения токсичности природных пресных вод и дойных отложений, сточных вод и отработанных буровых растворов МПР РФ (2002) рекомендовано применение методик биотестирования по снижению уровня биолюминесценции бактерий Photobacterium phosphoreum , уменьшению прироста количества инфузорий Tetrahymena pyriformis , угнетению роста пресноводных водорослей Scenedesmus quadricauda, гибели ракообразных Daphnia тадпа и Ceriodaphnia affinis, выживаемости и плодовитости ракообразных Ceriodaphnia affinis, гибели рыб гуппи Poecillia reticulata.

Оценку токсичности морских вод и донных отложений, сточных вод разной степени солености и отработанных буровых растворов, сбрасываемых в морские воды, МПР РФ рекомендуется проводить с помощью методик биотестироваиия по угнетению роста одноклеточных морских водорослей Phaeodactilum tricomutum , гибели ракообразных Artemia salina и рыб Poecillia reticulata, снижению уровня биолюминесценции бактерий Photobacterium phosphoreum.

Анализ флуоресценции водорослей и высших растений используется в целом ряде биологических тест-систем, применяемых в экотоксикологии. По интенсивности флуоресценции, возбуждаемой постоянным светом, можно определить в морской воде концентрацию хлорофилла при низких ее значениях (до 0,05 мг/м 3 хлорофилла а). Изменения флуоресценции при варьировании интенсивности возбуждения могут служить показателем фотосиптетической активности и физиологического состояния фотосинтезирующих организмов. Методика измерений обилия и индикации изменения состояния фитопланктона в природных водах флуоресцентным методом (ФР.1.39.2011.11246, ПНДФ 14.2.268-2012) допущена для целей государственного экологического контроля по разделу «Количественный химический анализ вод» (Котелевцев и др., 2012). В целом метод позволяет дать интегральную оценку качества природной воды, поскольку изменение фотосинтетической активности может быть вызвано и ее загрязнением, и неблагоприятными факторами среды, такими как высокая температура и соленость, недостаток элементов минерального питания и др. (Мелехова, 2007; Кузнецова и др., 2011). В современной практике широко используются стандартизированные методы биотестирования токсичности проб поверхностных пресных, грунтовых, питьевых, сточных вод, водных вытяжек из почвы, осадков сточных вод и отходов на пресноводных зеленых микроводорослях рода Chlorella и Scenedesmus , культивируемых по общепринятой методике. Основными показателями токсического действия служат рост и выживаемость культуры, изменение уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей (К). С. Григорьев // ПНД Ф Т 14,1:2:4,10-04, М.2004 ФР. 1.39.2007.03223; Н.С.Жмур, Т. Л. Орлова // ФР.1.39.2007.03223/2007 и др.). В последнее время появились работы по биотестированию влияния наиочастиц на экосистемы (рис. 26). Перспективными объектами для тестирования наноматери- алов считаются водоросли, в которых в качестве биосеисоров токсикологического воздействия исследовались ингибирование роста, изменение морфологии клеток и флуоресценция (Котелевцев и др., 2012). Так, например, обнаружено влияние наиочастиц серебра, иаиотрубок, ианоалмазов и наиокомпозитов на флуоресценцию водорослей Chlorella vulgaris и Chlamydomonas reinhardtii (Маторин и др., 2009).

Для комплексного экологического мониторинга изменения морской среды в районах разработки морских нефтегазовых месторождений С. А. Патин (1997) предлагает использовать тест-реакции бактерий, простейших Stylonichia mytilis, Tintinnop-

Рис. 26.

sis biroidea, Noctiluca seintillans, Cristigera , одноклеточных водорослей Coscinodis- cus, Ditylum, Gyrodinium, Exuviella , макрофитов , зоопланктона Acartia, Eurotimora, Tigriopus, Calanipeda, Artemia salina , рыб Salmo gairdner, Trachurus trachurus, Limanda limanda, Gadus morhua, Scophthalmus ma- ximus, Sprattus sprattus, Spicara smarts и макробентоса и др. (табл. 10).

Для определения токсичности техногенно загрязненных почв широко применяются измерение всхожести семян и длины корней проростков высших растений (РД 52.18.344-93, ИСО 11269 и др.). В частности, с этой целью изучаются семена овса Ovena sativa (Методика СПб НИЦЭБ РАН, ФР. 1.39.2006.02264), редиса Raphanus sativus (Нечаева и др., 2010; Воронина, 2013), кресс-салата Lepidium sativum (Ерем- ченко, 2013; Зейферт и др., 2013; Майстренко и др., 2013), гороха Pisum sativum (Крятов и др., 2013), горчицы Brassica juncea L. (Лисовицкая, 2013), сосны обыкновенной Pinus sylvestris (Фрейберг и др., 2002; Стеценко, 2004) и др.

Для оценки устойчивости растений к повышенному содержанию в среде ТМ в лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института АН СССР была разработана модификация метода корневого теста (Алексеева-Попова, 1985, 1991). Благодаря простоте и оперативности (экспрессиости), достаточно высокой чувствительности он является наиболее широко применяемым в вегетационных опытах. Это экспресс-метод определения устойчивости объектов на проростках в течеТаблица 10. Рекомендуемые группы и виды морских организмов и их тест-реакции для использования при биотестировании в системах комплексного экологического

мониторинга (Патин, 1997)

Группа и вид тест-организмов	Тестируемая среда	Тест-реакция и показатель
Гетеротрофный микропланктон, бактерии	Вода, поверхностный микрослой толщиной около 1 мм (ПМС)	Изменение динамики ВПК, видового доминирования, скорости разрушения субстратов, мутагенной активности
Простейшие (Stylonichia mytilis, Tintinnopsis biroidea, Noctiluca seintillans, Cristigera)	Донные осадки, норовые воды, элюаты, шламы, стоки	Снижение выживаемости, изменения темпов размножения и скорости роста, нарушения подвижности и морфологии
Одноклеточные водоросли, региональные доминанты (Coscinodiscus, Ditylum, Gyrodinium, Exuviella идр.)	Вода, стоки	Изменение скорости деления и численности клеток, нарушения интенсивности фотосинтеза и флуоресценции, аномалии пигментного состава и др.
Макрофиты (Laminaria, Macrocystis pyrifera и др.)	Вода, стоки	Изменение скорости роста, нарушения оседания зооспор, морфологические и электрофизиологи- ческие аномалии
Зоопланктонные фильтраты (Acar- tia, Eurotimora, Tigriopus, Calanipe- da, Artemia salina и др.)	Вода, ПМС, стоки	Снижение выживаемости и плодовитости, нарушение воспроизводства, поведения и трофической активности, морфологические и другие аномалии
Рыбы (икра, личинки, молодь) (Sal- mo gairdner, Trachurus trachurus, Limanda limanda, Gadus morhua, Scophthalmus maximus, Sprattus sprattus, Spicara smarts и др.)	Вода, ПМС, стоки	Повышение смертности и частоты морфологических аномалий, нарушения питания, роста, дыхания, поведения, физиологических и других показателей
Макробентос (взрослые эмбрионы, личинки) (Mytilus edulis, Crassostrea gigans, Macoma, Echinocardium, Arenicola и др.)	Вода, ПМС, донные осадки, стоки, шламы	Снижение выживаемости, нарушение размножения, замедление роста, поведенческие, физиологические и другие отклонения от нормы

ние 2-3 недель: состав контрольного раствора позволяет выращивать растения разных таксонов и опробовать большой диапазон концентраций металлов. В условиях одного опыта возможна оценка специфичности действия отдельных металлов, а также сравнение устойчивости разных видов и популяций одного вида к определенному металлу. Под воздействием токсичных концентраций ТМ наблюдается ингибирование ростовых процессов. Снижение прироста корней коррелирует с концентрацией металлов, причем реакция корней ярко проявляется даже при незначительном увеличении дозы металла. С помощью метода корневого теста установлены меж- и внутривидовые различия устойчивости к Си, Ni, Mn, Zn, Pb и Сс1 растений различных систематических таксонов (злаков сем. Роасеае - пшеницы, овса, ячменя; двудольных -сем. бобовых Fabaceae, сем. крестоцветных Brassicaceae , сем. сложноцветных Asteraceae , сем. губоцветных Lamiaceae и др.). Результаты проведенных лабораторных исследований позволяют рекомендовать метод корневого теста для выделения металлоустойчивых популяций видов, пригодных для выращивания па сельхозугодьях в загрязненных условиях, а также для рекультивации нарушенных земель.

Биотестирование является значительно более оперативным способом оценки качества вод по сравнению с традиционными подходами к контролю состояния окружающей среды. Этот способ менее дорогостоящ, а методы его проведения и результаты более доступны для понимания неспециалистом. Методы биотестироваиия постоянно совершенствуются, предлагаются новые подходы и аппаратура для проведения экспериментов, проводится их аттестация и патентование (Григорьев, Шашкова, 2006; Жмур, 2007; Жмур, Орлова, 2007; Маячкина, Чугунова, 2009; Мальцева, Охапкина, 2010; Григорьев, Тютькова, 2011; Бардина и др., 2013; Григорьев, 2013 и др.).

В настоящее время как в России, так и за рубежом интенсивно развиваются исследования по созданию средств автоматического контроля загрязнения акваторий в режиме реального времени. Наиболее перспективными в этом отношении считаются методы, основанные на измерениях реакций физиологических и поведенческих биомаркеров (Куриленко, 2004; Кармазинов и др., 2007; Холодкевич и др., 2006, 2011 и др.). Чаще всего используются методы регистрации кардиоактивности бентосных беспозвоночных с жестким наружным покровом, например раков, крабов, моллюсков. В каждой конкретной акватории в качестве «вида-мишени» могут выступать различные представители бентосных сообществ. Так, например, в настоящее время на всех водозаборах водопроводных станций Санкт-Петербурга применяется разработанная в СПб НИЦЭБ РАН установка биологического мониторинга качества воды, осуществляющая в реальном времени определение токсичности воды, поступающей из реки Невы. В качестве биомаркеров используются частота сердечных сокращений и стресс-индекс - одна из важнейших характеристик вариационной пульсометрии. Непрерывность и бесперебойность измерений этих физиологических параметров обеспечивается с помощью специальных проточных аквариумных систем, содержащих по три пары речных раков Pontastacus leptodactylus Esch.

В целом при оценке уровня токсичности среды метод биотестироваиия, как дополняющий химико-аналитический комплекс, обладает рядом несомненных достоинств:

• 1) тест-объект, как правило, реагирует на относительно слабые антропогенные нагрузки вследствие эффекта кумуляции дозы вредного воздействия;
• 2) в тесте суммируется действие всех без исключения биологически вредных антропогенных факторов, включая физические и химические воздействия;
• 3) по результатам тестов достаточно надежно вскрываются тенденции изменения ситуации в окружающей среде.

Однако выявлен и целый ряд трудностей применения обсуждаемого метода. Существенной проблемой использования простейших организмов является их несопоставимость с многоклеточными, реакция которых па те же самые изменения в водной среде может быть отличной. Так, например, для инфузории реакция на ТМ отмечается уже при концентрациях па несколько порядков ниже ПДК в воде. В отношении биогенных соединений всё наоборот: реакция проявляется при концентрациях, па несколько порядков превышающих ПДК. Кроме того, недостатками метода являются низкая надежность, сложность трактовки результатов и их переноса с одного вида на другой, отсутствие разработанных оценочных шкал. Все это сильно осложняет процесс стандартизации метода, без чего сам механизм государственного тестового контроля отладить практически невозможно.

Во избежание хотя бы части перечисленных трудностей в последние годы специалистами предлагаются новые научно-методические подходы к выбору тест-организмов на основе эволюционных, физиологических, психо-поведенческих и других особенностей (Зайцева, Ковалев, 1994). Суть этих предложений заключается в учете основных особенностей адаптационных процессов и данных о чувствительности и резистентности тест-организмов, во введении в практику биотестировапия элементов отологического анализа, а также в правильности определения сроков тестирования. По перечисленным критериям наиболее подходящими являются беспозвоночные гидробиоиты (ракообразные и брюхоногие моллюски), обладающие достаточно высоким уровнем организации. Применительно к тестированию дойных осадков в качестве тест-объектов рекомендуются донные беспозвоночные (Гудимов, Гудимова, 2002). Обосновывается целесообразность одновременного с общей оценкой токсичности вод проведения тестов па загрязняющие вещества. В этом случае может быть использована способность некоторых организмов реагировать па конкретные поллютанты. Серьезные усилия необходимо приложить к разработке единых шкал биологической оценки токсичности сред.

Кроме того, при проведении биотестирования твердых компонентов необходимо учитывать несколько аспектов. Во-первых, результаты определения токсичности почв и водных вытяжек из них методом биотестирования в некоторых случаях могут существенно различаться (Бакина и др., 2004; Маячкина, Чугунова, 2009). Например, токсичность почв, определяемая методом проращивания семян высших растений непосредственно в почве, выше, чем токсичность водных вытяжек из этих же почв, определяемая па традиционных для водной токсикологии тест-объектах. Разница результатов особенно велика при загрязнении почв токсикантами, малорастворимыми в воде, например пефтыо или продуктами гидролиза иприта. Во-вторых, при определении степени токсичности почв методами биотестирования большое значение имеет чувствительность подопытных организмов к токсикантам. Наиболее корректный результат достигается при использовании нескольких тест-объектов из разных систематических групп. В нормативных документах рекомендовано использовать как минимум два тест-оргаиизма. В научной литературе опубликованы разработки по созданию тест-системы, состоящей из трех-четырех представителей животного и растительного мира. Так, например, в качестве тест-организмов могут быть задействованы представители трех трофических уровней: продуцентов - Triticum vulgare L коисумеитов - Daphnia magna Straus, Paramecium caudatum ; редуцентов - почвенные микроорганизмы (Бардина и др., 2013; Капелькииа и др., 2013). Показательны проведение биотестирования, например, с аквариумными рыбками гуппи, моллюсками и рачками дафнии или применение системы Paramecium caudatum - Chlorella vulgaris - Escherichia coli. При этом используются следующие критерии: в случае гибели 50% особей одного организма вода оценивается как слабо токсичная, в случае гибели 50% особей всех испытуемых видов - как сильно токсичная.

Верификация комплекса биоиидикациоииых методов для оценки состояния окружающей среды может проводиться как в лаборатории в условиях контролируемого эксперимента, так и с помощью различных статистических приемов оценки достоверности взаимосвязи индикатора с объектом индикации. К их числу относятся регрессионный, факторный и кластерный анализы. Выбор метода зависит от конкретных задач и масштабов индикационной оценки территории.

Таким образом, в настоящее время разработано и широко используется в практике экологического мониторинга большое количество методов и приемов биоииди- кации. Фитоиндикационный метод позволяет оценить комплексное антропогенное воздействие и его экологические последствия в естественных природных и техно- генно нарушенных ландшафтах. Он незаменим при выполнении изысканий в труднодоступных районах и там, где отсутствуют посты мониторинговых наблюдений. В зависимости от интенсивности антропогенной нагрузки комплекс методов фитоиндикации изменяется. Физиологические и биохимические признаки индикаторных видов позволяют установить нарушения на ранних стадиях антропогенного воздействия па экосистемы. Морфологический анализ и использование тест-объектов рекомендуются во всех типах экосистем для получения оценки комплексного антропогенного воздействия. Применение тест-объектов в условиях опыта позволяет установить количественные связи в системе «доза -эффект». Для экспресс-оценки экологического состояния индустриальных регионов с разной степенью нарушенное™ перспективно применение различных фитоиидикациоиных методов. Флористический и фитоцеиотический методы могут быть использованы в районах природных геохимических аномалий и в слабоиарушениых природных экосистемах. Морфологический анализ и применение тест-объектов рекомендуются во всех типах экосистем для получения качественной оценки комплексного антропогенного воздействия. Для количественной характеристики и идентификации источника загрязнения в комплекс методов должен входить анализ содержания поллютантов.

В слабоиарушениых природных экосистемах под влиянием локальных источников загрязнения фитоиидикация направлена на контроль за одним или несколькими основными факторами антропогенного воздействия. В зависимости от характера источника загрязнения система рекомендуемых методов фитоиидикации будет меняться. Поскольку в этих условиях доминирует природный режим функционирования экосистем, то, к примеру, при контроле эмиссионных выбросов в атмосферу эффективны лихеноиндикация, дендроиндикация, сравнительный анализ биопродук- тивности естественных и нарушенных земель, контроль за изменением химического состава компонентов экосистем. Изучение эпифитного лишайникового покрова может быть рекомендовано для внедрения в практику мониторинговых работ, так как методика предусматривает возможность учета как всего видового разнообразия и обилия лишайников, так и суммарного проективного покрытия эпифитного покрова в целом. Последнее не требует глубоких знаний лихенологии и может использоваться широким кругом специалистов.

При деструктивных антропогенных изменениях ландшафтов, включающих де- форестизацию, мелиорацию земель, рекреационную и пастбищную дигрессию и т. д., наибольший эффект дает флористический подход (изменение видового состава фитоценозов, появление или исчезновение индикаторных видов) в сочетании с анализом изменения биопродуктивиости. Состояние фитоцеиозов можно оценивать традиционными способами учета биомассы методами укосов и транссект, по высоте травостоя или индикаторных видов растений и по ежегодному линейному и радиальному приросту деревьев. Изменение химического состава растений в этом случае менее специфично и не является обязательным.

В экосистемах в районах техногенных аномалий трансформация ПТК настолько велика, что в этих условиях невозможно использование фитоценотических и лихе- ноиндикациониых приемов. Для оценки пространственной дифференциации местности по степени загрязнения необходим выбор одного-двух (взаимозамеияюгцих) индикаторных видов, повсеместно распространенных па территории исследований. Антропогенное воздействие, сопровождающееся загрязнением компонентов экосистем, приводит наряду с изменением химического состава растений к угнетению жизненных функций и всевозможным нарушениям в ходе физиологических процессов, и прежде всего в фотосинтетической деятельности. Чувствительным показателем является соотношение содержаний хлорофиллов а и 6, однако такие исследования требуют достаточно хорошо оснащенной лаборатории и определенной подготовки специалистов. При проведении крупномасштабных мониторинговых работ удобнее использовать боиитировочиые шкалы хлорозов и некрозов листьев, а также возраста хвои отдельно стоящих деревьев или кустарников. Изучение изменчивости спектральных отражательных свойств фотосинтезирующих органов перспективно для экспресс-оценки антропогенных воздействий.

Особое значение имеет выбор биоиидикациоииых методов оценки урбанизированных территорий - урбоэкосистем. Наибольшая напряженность экологической обстановки наблюдается в крупных индустриальных городских агломерациях. Растения, как главные аккумуляторы токсических соединений, в городской среде играют важную роль в ее оздоровлении, испытывая при этом воздействие загрязняющих веществ, угнетающих их жизнедеятельность. Накопление поллютантов в растениях отражает уровень атмосферного и почвенного загрязнения урбоэкосистем. Использование фитоиидикаторов позволяет установить временную динамику загрязнения, дифференцировать основные его источники и определить их вклад в суммарное загрязнение. При изучении крупных городов одной из серьезных проблем является выбор эталонов сравнения. Частично эта проблема решается благодаря использованию тест-объектов. Тестирование среды успешно применяется как для оценки загрязнения городской среды, так и для экологического картографирования отдельных промышленных районов города. Наиболее эффективно в этом отношении брио- и лихеноиндикационное тестирование среды. Изучение состояния самого растения - угнетения жизненных функций, хлороза и некроза, морфологической изменчивости - лежит в основе экспресс-методов оценки загрязнения городской среды. Характер адаптации растений к техногенным нагрузкам во многом аналогичен адаптационной стратегии растений природных геохимических аномалий. Поэтому перспективны изучение и сравнительный анализ природных и техногенных популяций растений, устойчивых к высоким концентрациям металлов.

Таким образом, подводя итог вышесказанному, нужно подчеркнуть, что к числу преимуществ биоиидикации перед инструментальными методами следует отнести ее относительно низкую стоимость, высокую скорость получения информации и возможность характеризовать состояние среды за длительный промежуток времени. Применение биоиидикациоииых методов в сочетании с компьютерными технологиями и экспертной оценкой дает возможность сделать прогноз изменения экосистем при нарастании антропогенной нагрузки, сформулировать рекомендации по оптимальному режиму природопользования, оценить степень экологического риска антропогенного загрязнения.

Для решения ряда прикладных задач природопользования необходимы экспресс- методы экологической оценки состояния среды. К ним относятся прежде всего морфологический, флористический и фитоценотический методы. Преимущество их обусловлено относительной простотой натурных исследований и сбора информации, а также возможностью определения суммарного воздействия всего комплекса факторов в конкретных условиях.

Биоиидикация позволяет оценить комплексное антропогенное воздействие как на природные объекты, так и на территории урбо- и агроландшафтов. При этом можно использовать два подхода в оценке реакций организмов на воздействие окружающей среды. Первый предусматривает изучение реакций видов и их сообществ, распространенных на исследуемой территории, второй - изучение реакций растительных тест-объектов, искусственно размещенных на дайной территории.